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牛的胚胎移植技术

对于家畜的遗传改良,胚胎移植能从基因层面更好的展示母畜的优良血统。胚胎移植技术距今已有110多年的研究发展历史。虽然人工授精技术已经广泛应用于家畜的遗传改良,但是胚胎移植也已证明是一种极为强大的技术手段,特别是用于优良血统母畜的基因扩繁。对于奶牛业,推广优良母牛采用超数排卵和胚胎移植(MOET),能更好的促进良育繁育。



牛的胚胎移植技术  第1张

1 激素处理


对牛进行单个胚胎的收集,通常在对超排供体母牛进行激素处理后,再进行大量的胚胎移植。在牛,有2种超数排卵(超排)技术:一种是在发情期第10天(将出现发情的当天规定为第0天)肌内注射PMSG 2000~2500IU,之后2~3d每隔12~24h注射2次前列腺素PGF2α。发情牛需做直肠检查,以确认卵泡,若在发情后1.5d以后排卵的不能用作受体牛。


另一种方法是注射FSH。使用PMSG的超排效果强于FSH,但使用FSH得到的胚胎质量却更高,所以商业上常使用FSH进行超排。商业应用的FSH来自猪脑垂体提取物,混有LH。然而如果混有过多LH干扰FSH的最佳超排效果,但是少量的LH反而更有利于FSH的超排效果。


据报道称,一次性注射FSH可以获得满意的结果,但应连续肌内注射FSH 4~5d,每日2次为最佳。商业用FSH用生理盐水稀释到20mL,然后连续使用4~5d。使用FSH注射4d的方法是:第1天每次4mL,每日2次;第2天每次3mL,每日2次;第3天每次2mL,每日2次;第4天每次1mL,每日2次,总量为20mL。出现发情后第10天应用FSH。应用FSH后第3天或第4天注射PGF2α,12h后重复1次。36~48h后出现发情,发情开始后12h及24h观察体温变化,以进行人工授精,或在72h、84h、96h应用hCG或GnRH促进排卵。对奶牛可用的超排方法很多。比如超排前注射雌二醇或者阴道抽取优势卵泡。这些方法的目的是获得更多可用胚胎。



牛的胚胎移植技术  第2张

2 受体处理


观察到供体自然发情后,应同步对受体进行处理。供体牛和受体牛的比例一般为1:6~8。受体要选择体格大,膘情好,繁殖机能正常的适繁健康母牛。


在移植前6~8周,对受体母牛逐头注射VA、VB、VD、VE针剂,补充微量元素。在供体首次注射PGF2α12h之前受体应注射PGF2α,受体会与供体同期排卵,但通过比较,供体与受体注射PGF2α相差±1d比较好。超排率可以达到75%~90%,但20%~30%超排的母牛所产胚胎质量不好。使用FSH可以获得高质量的胚胎(每次能冲洗出0~20个以上的胚胎)。每次收集胚胎平均能获得5~7个高质量的胚胎,即可认为是满意的商业结果。



牛的胚胎移植技术  第3张

3 胚胎采集和处理


可在发情周期第7天即胚胎定植子宫时进行胚胎采集。在采集胚胎之前,超排之后供体母牛触诊子宫可摸到黄体


从子宫液中采集胚胎方法如下:①5~7mL利多卡因硬膜外腔麻醉。②使用肥皂或消毒剂洗净外阴,用量依据动物及其子宫颈大小,将安装有金属杆的导尿管插入阴道,用伸入直肠的触诊手臂将导尿管导入子宫颈。③插入子宫颈后,将导尿管深入到一侧子宫角上1/3处;取出导尿管里的金属杆,管口充满15~20mL空气,空气量与子宫角大小有关,也与品种、年龄、胎次等有关。④子宫颈中含有冲洗液,该液体富含抗生素及牛血清白蛋白,有些还有表面活性剂以减少胚胎形成泡沫。⑤用冲洗液冲洗子宫焦,每次25~50mL,少量重复多次,将冲洗液导入胚胎滤器,可持续冲洗子宫兔,或使用1~2L冲洗液连续冲洗子宫。⑥冲洗完成后,冲洗液会流入胚胎滤器中。⑦胚胎滤器送到实验室后,应将其内容物放入检查盘中,可在10倍解剖显微镜下观察。将所有观察到的胚胎移入到另一个干净培养皿中,培养皿中有含有10%~20%胎牛血清或0.4%牛血清白蛋白的缓冲液。然后在40~60倍的高倍镜下观察胚胎,依据胚胎形态、发育程度(未受精卵母细胞、早期桑葚胚、紧密桑葚胚、胚泡、扩张胚泡、孵出胚泡等)、质量(优秀、良好、一般、差劣、变质)进行分类。质量判定依据胚胎的完整性、胚胎发育情况、细胞质颜色、细胞退化、卵裂球数量、卵周隙距离和胚胎大小等形态特征进行评估。


只有中等、良好或优秀的胚胎可以移植;至少清洗胚胎3遍之后将其保存在培养液中。将移植的胚胎移入干净的含有培养液的器皿中,目的是剔除细胞碎片及可能黏附在透明带上的病原体。在室温下保存胚胎,直到移植入受体中或冷冻或进行性别判断。



牛的胚胎移植技术  第4张

4 胚胎植入


胚胎移植时可用0.25mL细管分三段吸入PBS保存液,中间由2个气泡隔开,中断含有胚胎。胚胎移植枪放在一个无菌的套子里,以避免移植枪头部对动物会阴部和阴道造成污染。借助于直肠检查,将移植腔送入子宫颈,然后再插入同侧带有黄体的子宫角。细管里的胚胎等内容物要尽量置于细管顶端,以避免延长不必要的手术时间。第一次接受胚胎移植后,60%~70%的受体可以妊娠,移入2个胚胎的受孕率可高达90%。大量的牛移植胚胎都是经过良好处理的冻融胚胎(46%),一般的受孕率在50%以上。在同样的条件和熟练的操作技术下,冻融胚胎理论上比新鲜移植的胚胎受孕率低10%。孕酮具有保胎作用,注射孕酮,可提高受胎率。早期确诊的方法有放射免疫测定和酶联免疫测定。虽然移入的胚胎量越多动物的妊娠率越高,但是由双胎引起的难产和胎衣不下的危险率也会增高,而且由此而导致的异性孪生不孕的可能性增高,从而限制了这种方法的广泛应用。


作者简介:吴长玉 兽医师


王廷斌 孙明林


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